多功能酶标仪又称多功能微孔板检测仪，是生命科学及理化研究室中常见和必备的检测仪器。一款功能完备的多功能酶标仪具有多个不同的功能模块，以满足不同实验和研究方向的需求。常见的功能模块包括：紫外/可见吸收光检测、荧光检测、发光检测、时间分辨荧光检测、荧光偏振检测、Alpha筛选检测。其中每一个功能模块又能配合不同的检测试剂，完成多种的检测项目。

一、        紫外/可见吸收光检测。

由于采用光栅设计，因此可以覆盖从紫外到红外区的连续光谱任意波长的检测。吸收光检测主要基于朗伯比尔定律定律，样品的吸光度值和样品的浓度成一定的关系，因此可以根据吸光度值对样品的浓度进行推算。常见的应用举例：

1. 酶联免疫吸附实验（ELISA）：ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

ELISA检测试剂盒品种多样，适合各类蛋白及分子的特异性抗原抗体识别检测。

2. 生物大分子定量：利用纯蛋白在280nm和核酸在260nm有独特吸收的原理，可以通过酶标仪的吸收光模块进行高通量的核酸蛋白样品定量。另外可以选择BioTek的微量样品检测板，进行体积为2μL的核酸样品的吸收光定量。

3. 细菌、细胞密度测定：当光线通过微生物或细菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由酶标仪精确测出。一般采用OD600对细菌培养液的浓度进行测定。

4. 细胞活性检测（MTT、XTT、CCK8）：活细胞内的分子可以与测试试剂结合反应，并呈现有颜色的溶液，可以通过溶液的OD值判断活细胞的数量多少。

5. 酶活性测定：主要通过可以和酶相互作用的底物进行反应，并加入标记的测试试剂，反应溶液呈现特定的颜色，在一定范围内酶的活性与溶液的颜色呈比例关系。酶标仪所具有的温控模块可以良好的控制酶活反应时检测仓内的温度，同时动态监测的程序测定可以保证获得酶在一段时间内的活性情况。实验结束后软件会自动给出曲线及相关反应速率。

6. 内毒素检测：根据被内毒素激活的凝固酶水解鲎三肽（最新产品是鲎四肽）中精氨酸肽链，释放出硝基笨氨（PNA黄色A,405nm）用冰醋酸中止反应进行吸光度测定，或用游离的PNA和偶氮试剂反应，最终形成偶氮兰复合物显色而进行比色测定的一种方法。

7. 光谱分析与光谱图绘制：酶标仪的吸收光检测为全光谱检测，因此可以针对每一个样品进行特定光谱区段或全光谱的扫描检测，并绘制出光谱图，该方法适用于位置样品特征光谱图的检测与绘制。

二、        荧光检测。

荧光物质、探针、蛋白与待测样品相结合，特定波长进行激发，受到激发的样品会发出荧光，在一定范围内，发射光的强度和样品的浓度成比例关系。常见应用举例：

1. 报告基因检测：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因与目标蛋白融合表达，因此对荧光蛋白发射光的定量可以代表目的蛋白的表达量。采用激发和发射光栅/滤光片进行样品的激发和发射，并可以根据相关样品参照来进行半定量测定和比较，或根据标准曲线进行绝对定量。

2. 生物大分子精确定量：选择特异荧光染料可以插入双链DNA的碱基中，或标记目的蛋白，使用该荧光染料的激发光进行样品检测，则可通过发射光信号的检测来进行样品精确定量。另外也可以通过Take3板和荧光检测模块进行体积为2μL的微量荧光样品定量。

3. 细胞凋亡：选择能够被Caspase切割的底物，在其上耦联特殊的荧光染料，当Caspase进行切割作用的时候，荧光染料从底物上被释放出来，进而使得该染料的荧光特性发生改变。随后在酶标仪上检测这种荧光信号，荧光信号的强弱和Caspase的活性成一定关系。市售有Caspase各类因子的检测试剂盒。

4. 细胞增殖：CyQUANT法采用荧光染料进行标记检测，这种荧光染料可以与核酸（DNA/RNA）相结合，可以进行细胞计数或细胞增殖情况的判断，因此适用于快速、定量的筛选影响体外不同类型细胞增殖的因子。这种方法简单快速，无需多步Buffer清洗过程，和长时间的孵育过程。检测激发波长480nm，发射波长530nm。

5. 钙流检测：采用可以和钙离子特异结合的荧光染料对细胞进行预染，当加入药物或刺激剂后，细胞膜离子通道打开，钙离子进入细胞，和细胞内染料结合，染料的光谱特性发生改变，通过酶标对该染料进行检测并配合自动加样器，可实现快速动态钙流监测及绘制钙流变化图谱。该原理同样适应于其他离子流检测。

6. 细胞迁移：采用Oris Pro细胞迁移检测板，细胞种植于板底水凝胶外围，随着细胞贴壁，水凝胶溶解，形成检测窗口，细胞采用荧光染料标记，细胞板配合遮蔽套板后，使用酶标仪对检测窗口内细胞的数目及荧光强度进行定量。

7. SNP筛查： 特异性SNP引物带有荧光标记与模板样品进行PCR扩增，经过三轮扩增后，仅可以正常配对的引物得以延伸和复制，可以根据不同荧光染料标记的荧光信号强弱来判断SNP类型及数量。KASP 筛选法非常适合高通量已知SNP位点筛查，其准确率高并可降低SNP筛选的成本。

8. FRET：采用能够产生荧光共振能量转移的荧光染料对儿分别标记不同的分子样品，当目标的分子发生相互作用，则可以在对样品进行激发后，监测到两种不同的发射光信号，采用酶标仪的荧光检测模块可以满足单激发双发射的快速检测及相应的比例计算。

9. RNA检测：可对活细胞内RNA的表达量增加进行测定。利用荧光标记寡合苷酸和纳米金颗粒可被细胞吞噬的原理，当细胞内RNA的表达量增加，则可和寡核苷酸配对结合，同时释放荧光染料，在相应的激发下测定发射光信号，并测定RNA的表达情况。

10. 免疫荧光：利用抗原抗体结合原理，目标蛋白可以和特异性的抗体进行结合，可以和特异性抗体识别的第二抗体上采用荧光染料进行标记，通过酶标仪的光路系统对样品进行激发和检测。发射光的强度和待测样品的浓度在一定范围能成比例关系。同样的检测原理也适用于基于细胞学的研究分析。

11. ROS检测：采用DCFH-DA预染细胞，并被细胞内酯酶降解为DCFH，当细胞内ROS增加可氧化DCFH为DCF，DCF则可受到激发而发出绿色荧光。

12. GUS检测： 4-甲基伞形酮酰-beta-D-葡萄糖醛酸苷（4-MUG），GUS将其催化水解为4-甲基伞形酮（4-MU）和beta-D-葡萄糖醛酸。4-MU分子可在365nm波长光的激发下产生455nm的发射光。本实验常用于植物报告基因检测。

三、        发光检测。

蛋白酶类报告基因或者特殊酶标记的抗体在加入底物后，发生生物化学反应，其反应能量是以光信号的形式发出，采用酶标仪的发光检测模块对发光信号进行测量，在一定范围内成比例关系。常见应用举例：

1. 虫荧光素酶报告基因检测：采用编码有虫荧光素酶报告基因的表达载体通过分子克隆与目的蛋白的编码序列融合表达并转染细胞，细胞裂解后分离上清并加入底物进行快速闪光检测，光信号的强度与目标蛋白的浓度成比例关系。为了保证定量比较具有可比性，新型的检测方式加入了可以校准的海肾荧光素酶的检测，因此配合自动加样器，可以完成双报告基因的检测。

2. 细胞毒性和微生物检测：基于ATP为活细胞或微生物能量来源的原理，在实验中对体系内ATP的含量进行测定，细胞或微生物的裂解液上清加入发光底物，通过酶标仪的发光模块对发光信号进行检测，光信号的多少代表活细胞或活微生物的多少。通过加入标准数量的细胞或微生物测定，则可以绘制标准曲线用于绝对定量。

3. 化学发光免疫检测：基于传统ELISA原理，用于目标蛋白的定量检测，在第二抗体上标记可以进行化学发光检测的酶，实验检测中仅需加入检测底物通过酶标仪对发光信号进行定量，信号的强弱与样品的浓度在一定范围内成比例关系。

4. 发光核酸探针检测：常见使用细菌或病毒特异性识别序列标记发光酶，在临床检测中用于测定样品中特定的细菌或病毒感染，样品核酸释放后可与特异探针结合，加入底物后发光，进而可以鉴定是否存在感染及感染类型。

5. 钙流检测：使用水母发光蛋白预染细胞，当外加药物或刺激剂促使离子通道打开，钙离子进入细胞和水母发光蛋白结合，加入底物后，可发出光信号，在一定范围内成一定的比例关系。

6．细胞色素P450活性测定：采用能够被P450作用的荧光素前体，在有NADPH存在的前提下，有活性的P450可以作用于该前体物质使其转化为荧光素在加入底物后可以产生发光信号并通过酶标仪进行定量检测。该应用主要进行P450相关药物的筛选测试。

7. 发光细菌：发光细菌试验是环境样品毒性检测的生物测试技术，发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而毒性物质则将抑制其发光，且毒性越强光抑制越明显，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性。另外，发光细菌本身没有危害性。因此我们可以称发光细菌为一种生物传感器，发光细菌为“生物利用度”这个词赋予了全新的概念，使测试毒性物质中的亚类毒性浓度成为可能。而酶标仪则可以用于准确、快速、高通量的进行发光信号的检测。

8. BRET（生物发光能量共振转移）： 该方法用于对活细胞内蛋白相互作用的研究。实验中通过分子克隆分别构建两种目标蛋白和两种报告基因的融合表达载体，共转染细胞，当加入研究试剂后，如果细胞内两种蛋白之间发生了相互作用，则在加入测试底物后可以监测到绿色荧光和海肾荧光的出现。本方法安全准确并无需裂解细胞。

四、        荧光偏振。

荧光偏振是利用光的偏振性原理，检测小分子和大分子相互作用的一类实验，实验中采用荧光染料标记小分子，反应体系用于测定小分子与大分子是否发生相互作用，由于结合后的分子体积增大，其偏振性发生改变，酶标仪的偏振检测模块可以通过测试来自水平方向和垂直方向的偏振光比例来判断分子间结合的程度。常见应用举例：

1. 细胞膜流动性：采用特异可以嵌合于细胞膜磷脂双分子层中的荧光染料来进行测试，由于荧光的偏振性受到所处环境变化的影响会发生变化，当细胞膜由晶态转换为液态，其偏振性下降，反之则增加。

2. 高通量SNP筛查：用于进行已知SNP的高通量筛查，分别用不同荧光染料标记不同的碱基分子，合成针对该SNP的引物，其长度截止于SNP位点之前，然后进行延伸反应，并加入标记的碱基分子，仅有配对的碱基分子被识别结合，并且其分子量突然增大，引起该分子所携带染料的偏振性发生改变。通过酶标仪对水平及垂直方向的偏振光进行比例分析，来判断SNP类型及数量。

3. 药物筛选：通过荧光标记小分子化合物，并与待研究的目标蛋白进行结合筛选，标记荧光染料的小分子一旦与蛋白质结合，分子量发生变化，同时使用酶标仪测定反应体系中水平和垂直偏振光的比例来判断蛋白与分子结合的情况。

4. EMSA检测替代：实验原理同样采用荧光染料标记DNA，并与特异性待测蛋白相互混合，使用酶标仪对反应体系的偏振性进行测定则可筛选出能与特定DNA结合的蛋白或者能够与特定蛋白相结合的DNA。

5. 布病筛查：布鲁氏杆菌提取的O型多糖（POS），用荧光染料进行标记，作为示踪剂，可以与布鲁氏杆菌抗体相互结合形成复合物，通过对复合物的偏振光检测，来进行检测判断。酶标仪则非常适合该检测的高通量样品测定。

五． HTRF（均相时间分辨荧光）检测。

实验选择可以产生FRET的荧光染料对，分别标记待测样品，用于测定分子间相互作用，受体配体分析，抗原抗体反应，核酸蛋白结合等实验。实验技术的核心为其中一个染料采用镧系金属标记，该染料在受到激发后，发光时间延长，通过闪烁激发和延迟检测，有效避免背景极大提高了检测灵敏度，且仅需加样检测，避免传统免疫分析中的洗脱步骤。常见应用：

1. cAMP及GPCR检测：采用竞争性免疫分析原理，使用荧光对分别标记抗cAMP抗体和外源性的cAMP，当细胞内源性cAMP增加释放则可竞争性抑制外源性cAMP和抗体的相互结合，进而对荧光信号的改变进行测定。cAMP作为GPCR通路的第二信使，经常被用于GPCR通路检测的目标分子。

2. 细胞膜受体与配体结合研究：通过硫酯取代反应将荧光染料标记在目标蛋白上。 采用Tag-Lite标记技术，将Eu标记于细胞膜受体后，当与XL665标记的配体结合， 产生FRET。可以用于测定受体配体结合能力以及结合常数测定、配体筛选等研究。

3. 激酶研究：采用荧光染料分别标记抗磷酸化抗体和可以被激酶所用的多肽，用于测定激酶的磷酸化能力，当激酶可以磷酸化该多肽，则可通过酶标仪检测到相应的荧光信号。

 六． Alpha筛选。

Alpha筛选是一种基于微球检测分子间相互作用的技术。检测中，供体球表面所覆盖的光敏剂可以受到680nm波长的激发而产生大量单线态氧，后者则可以和受体上的二甲噻吩衍生物发生反应并发出光信号，我们将需要研究的两种分子分别和供体球受体球相连接，当两球距离非常接近时，即可发生上述反应而检测到光信号，进而判断两种分子是否发生相互作用。该方法检测灵敏度高，背景控制良好。常见应用举例：

 1. 抗体筛选：采用微球标记目标蛋白和相关抗体分子，并将两种标记分子加入反应体系，通过680nm荧光对样品进行激发，随后检测是否存在发光信号，可以判定该抗体分子是否为目标蛋白的特异性抗体。

2. 核受体分析：采用微球分别标记孤儿受体及候选配体，并将标记分子加入反应体系，通过对发射光的检测，来筛选能够真正和孤儿受体相结合的配体。

3.  激酶分析：采用特异联合青霉素和蛋白A作为连接组件，随后标记上需要研究的激酶和激酶磷酸化抗体，如果目标激酶被磷酸化，则可被激酶磷酸化抗体所识别，并携带两个微球相互靠近，因此反应体系受到激发则可检测到相应的发射光信号，用以判断该激酶的活性。